光照強度對海洋綠藻脂和脂肪酸含量的影響
海洋微藻因富含AA、EPA和DHA等(n-3)PUFAs而備受關注。(n-3)PUFA的生理功能包括增強機體免疫系統功能、預防和治療多種心血管疾病、促進嬰幼兒智力及腦發育等，尤其是其中的AA和EPA是前列腺素及衍生物的前列環素、凝血烷、白三烯的天然前體，在機體的多種生理過程中起著重要的調節作用，因此微藻可作為人類的高級營養食品和藥品。微藻在水產養殖業中還是浮游動物(輪蟲、枝角類等)、甲殼類、雙殼類和幼齡魚類的餌料，其中含有的EPA和DHA等海產動物所必需的脂肪酸(EFA)，能夠提高其生長率和幼體的存活率。
海洋微藻的脂肪含量以及脂肪酸構成的數量和質量可隨環境因子而改變，如培養基中的營養鹽組成及比例、環境條件(光照、溫度、鹽度等)、生長時期等。光照強度影響微藻的光合作用和生長，從而對其體內生化成分產生影響。關于光照強度對海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響已有多個報道，但國內外對裂絲藻的研究尚未見報道。本文對1株裂絲藻和3株小球藻等4株海洋綠藻在不同光照強度培養時的相對生長率、總脂含量和脂肪酸組成進行了測定，以期找出其生長和脂肪酸合成的最適光照條件，為微藻的不飽和脂肪酸研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗所用微藻藻種取自中國海洋大學微藻種質庫：小球藻；桿狀裂絲藻；光量子計，浙江托普儀器銷售。
1.2 培養條件
對4個藻株作了不同光照強度(3000lx， 5000lx， 8000lx)的培養實驗。每個光照強度水平設3個重復。其中海水經沉淀后用脫脂棉過濾，煮沸消毒。采用f/2培養基。實驗于2L細口瓶中進行，連續充氣，連續光照，光照強度用光量子控制，鹽度28，室溫(20±1)℃。每天用血球計數板法計數細胞濃度。
1.3 微藻收獲
微藻在指數生長末期4 000×g離心15 min收獲，收集的藻泥經冷凍干燥后放入帶塞試管中，充N2氣-40℃保存。
1.4 相對生長率計算
利用下式計算相對生長率：
μ=(lnNt-lnN0) /T
式中，μ為每天的平均分裂速率；T為培養天數；N0為培養開始時的藻細胞數；Nt為培養T天后的藻細胞數。
1.5 總脂提取
總脂提取和測定按文獻方法進行。
1.6 脂肪酸分析
樣品處理及氣相色譜分析按文獻方法進行。取40mg左右樣品于離心管中，加入體積分數為2∶1的氯仿/甲醇溶液，振蕩后加入1 mL 2 mol?L-1NaOH-CH3OH溶液，充分振蕩后在75℃水浴中加熱15 min進行皂化，冷卻后加入2mol?L-1HCl-CH3OH溶液，調pH≤2，在75℃水浴中加熱15min，使其甲酯化，然后加入1mL正己烷振蕩，取上清液進行色譜分析。
氣相色譜分析采用美國HP5890II型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，Coawax carbowax毛細管柱(30 m×Φ0. 25 mm)，進樣口和檢測器溫度均為280℃，程序升溫，載氣為高純氮，流速2 mL?min-1，進樣量1μL。以面積歸一劃法得到各脂肪酸組分的相對百分含量。
1.7 數據處理
用SPSS 13. 0軟件分別進行單因子方差分析和多重比較。P<0. 05表示有顯著性差異。
2 結果
2.1 相對生長率
本文做了不同光照強度對4株海洋綠藻的相對生長率的影響，結果見表1。從表1可以看出，C97在中光強(5000lx)下獲得最大相對生長率，C19、C95和C102均在高光強(8000lx)下獲得最大相對生長率，且相對生長率隨光照強度的增加呈增加趨勢。單因子方差分析結果表明，光照強度對4株綠藻的相對生長率均有顯著影響(P<0. 05)。
2.2 總脂含量
本文做了不同光照強度對4株綠藻的總脂含量的影響，結果見表2。從表2可以看出：C19的脂肪含量在低-中光強(3000—5000lx)間變化不大，高光強下有所降低；C95的總脂含量隨光照強度的升高略有降低；C97和C102的總脂含量隨光照強度升高而明顯升高。單因子方差分析結果表明，光照強度對C95脂肪含量的影響沒有顯著性差異，而對C19、C97和C102的脂肪含量的影響有顯著性差異(P<0. 05)。多重比較結果表明：C19在高光照強度時總脂含量顯著低于其它各組，低光照強度和中光照強度處理間沒有顯著性差異(12?9%—12. 7% )； C97和C102則分別在高光照強度時脂肪含量顯著高于其它各組(分別為40. 6%和33. 3% )。
2.3 脂肪酸組成
本文做了3個光照強度水平(3000lx， 5000lx， 8000lx)對4株綠藻脂肪酸組成的影響，實驗結果見表3。
由表3可知， 14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、AA和EPA是4株綠藻的主要脂肪酸成份。小球藻C95的EPA含量在中低光照強度下含量較高，C97和C102的EPA含量隨光照強度的增加而明顯降低， SFA和MUFA總量隨光照強度的增加總體呈增加趨勢。桿狀裂絲藻C19的EPA含量隨光照強度的增加呈現低—高—低趨勢， SFA隨光照強度的增加呈降低趨勢，MUFA隨光照強度的增加呈增加趨勢。4株綠藻的20∶4n-6含量和PUFA總量均隨光照強度的增加而降低。
單因子方差分析結果表明：光照強度對C19的14∶0、16∶0、EPA含量及SFA、MUFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異；光照強度對C95的16∶1(n-7)、AA、EPA含量及MUFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異；光照強度對C97的16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶3(n-3)、EPA含量及SFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異；光照強度對C102的14∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、EPA含量及SFA、MUFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異。
多重比較結果表明，C19的EPA含量在中光照強度水平顯著高于其它處理(12.7% )，低光照強度和高光照強度處理間沒有顯著性差異；C95的EPA含量在高光照強度水平顯著低于其它處理，低光照強度和中光照強度處理間沒有顯著性差異(14.0%—14.7% )；C97和C102的EPA含量分別在低光照強度水平顯著高于其它處理(分別為12.0%和10.5% )。C19的16∶0含量和C95的AA含量在低光照強度水平顯著高于其它處理；C19、C95和C102的16∶1n-7含量、C97的16∶0含量均在高光照強度水平顯著高于其他處理，低光照強度和中光照強度處理間沒有顯著性差異；C19的AA含量在低光照強度水平顯著高于其它處理，中光照強度和高光照強度處理間沒有顯著性差異；C97的16∶1(n-7)含量在低光照強度水平顯著低于其它處理，中光照強度和高光照強度處理間沒有顯著性差異；C95和C102的18∶1(n-9)含量在中光照強度和高光照強度處理間有顯著性差異，其它處理間沒有顯著性差異；C97的AA含量和C102的16∶0含量在低光照強度和高光照強度處理間有顯著性差異，其它處理間沒有顯著性差異。4株綠藻的16∶4(n-3)、18∶2(n-6)和18∶3(n-3)含量較低。C19的SFA和PUFA總量分別在高光照強度水平顯著低于其它處理，在低光照強度和中光照強度處理間沒有顯著性差異(分別為41. 9%—42. 1%和19. 1%—19. 4% )；MUFA總量則在低光照強度水平顯著低于其它處理，在中光照強度和高光照強度處理間沒有顯著性差異(38.6%—39.2% )。在高光照強度水平，C97和C102的SFA總量(分別為42. 2%和43. 0% )及C95和C102的MUFA總量(分別為39.8%和42.3% )均顯著高于其它處理； C97和C102的PUFA總量均在低光照強度水平顯著高于其它處理(分別為19.2%和18.9% )，C95的PUFA總量則在高光照強度水平顯著低于其它處理，在低光照強度和中光照強度處理間保持穩定(均為21.3% )。
3 討論
微藻的脂肪酸組成在不同的培養條件下可能會有所變化，但仍保持其特殊的特征。綠藻綱富含16碳和18碳PUFAs，其特征脂肪酸是16∶4(n-3)和18∶3(n-3)，一些海產小球藻種有著較高含量的EPA，大多數的綠藻種類都僅含有少量的DHA或不含。在本實驗結果中， 4株海洋綠藻的主要脂肪酸組成為14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、AA和EPA，與前人的研究結果相符。
微藻的脂類物質包括中性脂(三酰甘油)和極性脂(磷脂和甘油脂)，三酰甘油通常含有更多的飽和與單不飽和脂肪酸，甘油脂則含有較多的PUFAs，磷脂的含量相對穩定。微藻細胞隨環境變化而改變各類脂的比例，從而也改變了脂肪酸的組成，光是其中最重要的因子之一。在Thompson等的研究結果中，球等鞭金藻的總脂含量在較低光強取得最大值，綠色巴夫藻的總脂含量則隨光照強度的增加(1120—18000lx)由低—高—低—高變化，在3520lx和18000lx光強下總脂含量最高。李荷芳等的結果表明小球藻的脂肪含量與光照強度呈正相關，而前溝藻的脂肪含量隨光照強度的升高反而下降。石娟等和EmdadiD等的研究也表明微藻在低光照下脂肪含量較高。本實驗結果中，C19的脂肪含量在高光強下有所降低，C95的總脂含量隨光照強度變化不大， C97和C102的總脂含量則隨光照強度升高而明顯升高，表明微藻的脂肪含量隨光照強度的變化因種而異。
早期的研究結果表明光照強度的增加有利于海洋微藻16碳和18碳PUFAs的形成，主要是16∶2(n-6)，16∶3(n-6)， 16∶4(n-3)， 18∶2(n-6)和18∶3(n-3)，LeeYK等的結果也表明紫球藻的18∶2、20∶4和20∶5含量隨光照強度的增加而增加， Seto等的結果表明微小小球藻的EPA含量隨光照強度的增加略有增加。但更多的研究表明，生長在高光強條件下的微藻不飽和脂肪酸的比例降低。Renaud等認為這是由于不同的微藻細胞中存在不同類型的去飽和酶，而這些酶的活性受光強的影響不同，并研究了不同光照條件下等鞭金藻和微綠球藻的脂肪酸組成，結果顯示，Isochrysissp.的EPA等幾種PUFA含量和N. oculata中的16∶2(n-4)、18∶3(n-3)、EPA含量及PUFA總量均隨光照增加而下降。在Sukenik等的研究結果中微綠球藻的AA、EPA含量、Molina-Grima等的研究結果中I. galbana的EPA含量以及Mortenson等的結果中纖細角毛藻(Chaetocerosgracilis)的16∶2(n-7)、18∶1(n-9)、18∶2(n-6)、18∶4(n-3)、AA和DHA含量均在高光強下比例降低，Thompson等的結果顯示當光強從18000lx下降到480lx時，簡單角毛藻中的EPA從6.1%增加到15.5%，而DHA從9.7%減少到3.6%。孫利芹等的研究結果表明中低光照有利于紫球藻AA和EPA的積累。廖啟斌等對三角褐指藻和小球藻、徐年軍等等對后棘藻、蔣霞敏對微綠球藻和綠色巴夫藻、繆錦來等對兩種南極綠藻以及LiangY等對三角褐指藻等6株海洋硅藻的研究中也發現PUFAs含量隨光強的增加而呈下降趨勢。
在本實驗結果中，小球藻C95的EPA含量在中低光照強度下含量較高，分別為14.0%和14.7%，高光照下降低至7. 3%，與孫利芹等的研究結果相似；C97和C102的EPA含量隨光照強度的增加而明顯降低，C97從12. 0%降至8.1%，C102從10. 5%降至6. 2%，與Thompson等、Renaud等、Sukenik等、Grima等和Mortenson等的結果相似。C19的EPA含量隨光照強度的增加呈現低—高—低趨勢(9. 1%—12.7%—9.0% )，表明桿狀裂絲藻在中等光照強度下能夠獲得EPA的最大值。4株綠藻的AA含量均隨光照強度的增加而降低，與Sukenik等和Mortenson等的結果一致，4株綠藻的PUFA總量均隨光照強度的增加而降低，與廖啟斌等、徐年軍等、蔣霞敏、繆錦來等及LiangY等的結果一致。產生這種變化的原因一方面可能是由于微藻細胞在高光照條件下生長快速，體內的PUFA得不到足夠的積累所致；另一方面還可能跟細胞內光合作用的機構有關，微藻細胞內的光合作用在葉綠體的類囊體膜上進行，富含PUFA的甘油脂是類囊體膜的主要組分，其數量與細胞的光合活力密切相關。低光照條件下，為了增加光吸收及光利用效率，膜脂的合成速率維持在較高水平，類囊體膜的表面積有所增加，因而PUFA含量增加。而當光強超過飽和光強時，引起了光合機構的損傷和光合速率的下降，膜脂合成速率降低，甚至受到破壞， PUFA含量隨之下降。
