PCR技術在食品檢測領域的最新應用進
云南農業大學食品科技學院王偉等擬文談到，隨著人們對食品安全性要求的不斷提高，PCR技術以其特異性強、靈敏度高和快速準確等優點在食品檢測領域得以廣泛的應用。
1 PCR的技術原理
根據已知的待擴增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補的兩段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進行擴增，這種方法也就是PCR技術。擴增過程由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等3步反應作為一個周期，反復循環，從而達到迅速擴增特異性DNA的目的。高溫變性是在體外將含有需擴增目的基因的模板雙鏈DNA經高溫處理，分解成單鏈模板，低溫退火降低反應系統溫度，使人工合成的寡聚核苷酸引物與目的DNA互補結合，形成部分雙鏈，適溫延伸是將反應循環系統的溫度調至適溫，在TaqDNA聚合酶的作用下，有4種核苷酸存在時，引物鏈將沿著5′→3′方向延伸，形成與模板互補的新鏈，新鏈又可作為下一次反應的模板，如此周而復始使目的基因的數量呈幾何級數擴增。
PCR技術檢測的主要步驟為：1運用化學手段對目標DNA提取；2設計并合成引物，引物設計與合成的好壞直接決定PCR擴增的成效，通常要求引物位于待分析基因組中的高度保守區域，長度為15～30個堿基為宜；3進行PCR擴增；4克隆并篩選鑒定PCR產物，將擴增產物進行電泳、染色，在紫外光照射下可見擴增特異區段的DNA帶，根據該帶的不同即可鑒定不同的DNA；5DNA序列分析。
不同的對象如擴增DNA片斷序列全知、半知或未知，其PCR參數、退火溫度、時間、引物等都有較大的差別，將RFLP、Sequence、反轉錄PCR等技術相結合，形成了眾多的衍生技術，如多重PCR，定量PCR，競爭PCR單鏈構型多態性PCR，巢式PCR等。這些技術的產生將使PCR技術在食品中的應用潛力更加廣泛。
2 PCR技術在檢測食品中有害微生物的應用
2.1 檢測食品中的沙門氏菌
沙門氏菌病是公共衛生學上有重要意義的人畜共患病之一，病原屬腸桿菌科，蛋、家畜和肉制品等都是主要的傳播媒介。1993年Song等人利用PCR技術成功的檢測到血液中的傷寒沙門氏菌DNA。1994年盧強等參考Rahn設計的引物，擴增了invA基因284bp的特異片段。
近年來，用PCR技術檢測沙門氏菌得到了迅速發展，產生了許多種PCR法，如常規PCR、套式PCR、多重PCR。也可幾種方法結合使用，如李君文等將常規PCR與半套式PCR相結合，根據沙門氏菌中保守的165rRNA基因為模板設計了一對引物，擴增的片段為555bp。經過優化設計反應條件，只對沙門氏菌產生特異性擴增，敏感性達30cfu。為了對擴增強果進行鑒定，又在這兩條引物之間設計一條半套式引物。經半套式PCR檢測下明第一次的產物是正確的，且靈敏度提高至3cfu。此外，還可將PCR與微孔板檢測、ELISA技術以及探針雜交有機結合起來。
2.2 檢測食品中的大腸桿菌
在大腸桿菌檢測中，主要的檢測目標是腸出血性大腸桿菌和腸毒素大腸桿菌兩種。腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC)是指能夠引起人類出血性腸炎的一類大腸桿菌，主要經口傳播。該菌引起的食物中毒首先在美國于1982年爆發，之后在世界各地相繼發現病例。盧林耿等在2001年進行的調查表明，我國的食品中也存在散發E.Coli0157的菌株。
王靜等經過研究建立了一種快速檢測食品中腸出血性大腸桿菌(EHEC)的多重PCR方法，將樣品增菌后，采用快速裂解吸附法制備模板，用多重PCR同時檢測EHEC的3種毒力基因eaeA、hlyAB、slt1/2，相應擴增片段依次為1109、302、228bp。檢測了60株大腸桿菌和其它菌種：結果12株大腸桿菌0157：H7、1株大腸桿菌026：H11和1株大腸桿菌0111：H8，同進檢出上述3種基因，2株EAEC檢出了eaeA基因，1株VTEC檢出了s1t1/2基因，其余43株大腸桿菌和非大腸桿菌未檢出上述基因。檢測食品中EHEC時，從樣品增菌培養到整個檢測過程結束不超過8小時，方法的檢出限≤1.6 cfu/g(mL)。檢測的126份食品樣品中，3份檢出了EHEC(包括牛肉、豬肉和生菜各1份)。試驗結果表明，該法是一種特異性強、敏感性高、省時、省力的EHEC檢測方法。
腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起嬰幼兒腹瀉的主要原因，也是導致“旅行者”腹瀉的重要原因。王嘉福等(1997)用自己設計的兩對引物，對食品中的大腸桿菌(ETEC)的熱敏性毒素(LT)基因和耐熱性毒素(ST)基因進行了PCR擴增，擴增出來的314bp和237bp DNA片段均能與相應的基因探針雜交，可以檢測出3種毒素基因型(LT、ST及LTST)的ETEC，具有快速和靈敏度高的特點。
2.3 檢測肉毒梭狀芽孢桿菌
肉毒梭狀芽孢桿菌產生的肉毒神經毒素，在天然物質中毒力最強。據報道，Nooki根據毒素A基因的非重復區段設計了兩對特異性引物(NK1－NK2和NK3－NK2)分別用于擴增長度為546bp和252bp的特異片段；又根據毒素A基因的重復區段序列，設計了另外一對引物NK11－NK9，用于擴增長度為1266bp的特異片段。此三對引物都能快速、特異地從肉食品樣品中檢測出肉毒梭狀芽孢桿菌。
2.4 檢測金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)可引起人類食物中毒，其內毒素——中毒休克綜合癥毒素(TssT1)可引起中毒休克綜合癥，產生的脫皮毒素(ETA、ETB)與一系列膿疤性葡萄球菌感染有關。Johenson等(1990)建立了檢測上述毒素基因的PCR技術，可在較短的時間內檢測出葡萄球菌毒株，并且具有極高的特異性和敏感性。
2.5 檢測單核細胞增多癥李斯特氏桿菌
李斯特氏桿菌廣泛存在于自然界當中，是影響食品衛生的重要病原菌。有資料顯示，在其傳播途徑中，動物性食品為主要傳染源。研究資料表明，李斯特氏桿菌的致病性由2個重要致病因素引起：李氏溶血素O和侵襲因子內化素，無李氏溶血素O的李氏桿菌不致病。王芳等采用ERIC－PCR方法，根據是否可以擴增獲得1600bp的DNA片段，作為鑒定單增李氏菌依據，并與國標鑒定方法進行對比，以確定ERIC－PCR方法的可靠性。試驗結果表明，兩種鑒定方法獲得的結果完全一致，這證明ERIC－PCR方法鑒定單增李氏菌具有可行性。
3 PCR技術在檢測食品中轉基因成分的應用
目前植物性轉基因食品的檢測采用的技術路線有兩條：一是檢測插入的外源基因，主要應用PCR法、Northern雜交及Southern雜交；二是檢測表達的重組蛋白，主要采用ELISA法、Western雜交及生物學活性檢測。PCR技術應用于轉基因產品的檢測，其敏感快速、簡便的特點是其它檢測技術所無法比擬的。
劉光明等根據轉基因農作物中常用的花椰菜葉病毒啟動子(CaMV 35S)和根癌農桿菌終止子(NOS)的序列，設計并合成了兩對不同的引物和相對應的兩種熒光雙鏈探針(FDCP)，分別建立了常規PCR、應用FDCP的新型實時熒光PCR檢測轉基因成分35S啟動子和NOS終止子的方法。試驗結果表明，兩種PCR方法均能有效檢測出35S和NOS片段，其中常規PCR方法具有靈敏度高、特異性好的特點；應用FDCP的新型實時熒光PCR方法則更為簡便、快速、準確。
曹際娟等應用PCR技術對轉基因(GM)玉米及其粗加工食品如：爆玉米花、熱玉米棒、速溶玉米片中通常轉入的基因構建元件35S啟動子、NOS終止子和外源抗蟲GryLA(b)目的基因進行檢測；對GM玉米的檢測低限可達到0.1％。
4 PCR技術在食品檢測領域的應用展望
PCR技術在食品檢測的實際應用中表現出靈敏度高、速度快、特異性強、簡便、高效等特點，為食品檢測技術的發展提供了有力的技術支持。但是，PCR技術在實際應用中也表現出一些缺陷，例如容易出現假陽性、假陰性，產物容易突變，不能檢測致毒微生物產生的毒素等。
隨著生物技術的飛速發展和各項新技術與PCR技術的有機結合，以及今后專門針對如何控制外源DNA的污染、如何控制突變和如何利用PCR技術鑒別致毒微生物產生的毒素等方面的深入研究，必將為PCR技術在食品檢測領域更加廣泛的應用提供新的思路。中國糧油儀器網 http://www.1004-75.com
