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5種入侵植物葉綠素的提取與含量測定
　紫莖澤蘭( Eupatorium adenophorum Sp reng)系菊科澤蘭屬多年生草本植物,一般高0. 8～1. 2 m,最高可達2. 5 m,莖暗紫褐色,被灰色銹毛,葉對生,葉片棱形;頭狀花序,瘦果五棱形,具冠毛;具有極強的生命力,全株有毒,不僅與農田、森林爭養料和水分,其纖毛、花粉等還會對人、畜造成危害。
飛機草( Eupatorium odoratum L. )為菊科植物,別名香澤蘭。植株高達3～7 m,根莖粗壯,莖直立,分枝伸展;葉對生,呈卵狀三角形,瘦果能借冠毛隨風傳播,其果實成熟季節多為干燥多風的旱季,擴散力強,蔓延迅速,種子休眠期短。植株有較強的異株克生作用,危害多種作物,并抑制鄰近植物生長,還能使昆蟲拒食。其葉內含香豆類素( coumarins)等有毒活性化合物,能引起皮膚紅腫、起泡,誤食嫩葉會引起頭暈、嘔吐,還可引起家畜、家禽和魚類中毒。
空心蓮子草(A lternanthera philoxeroides Bunbury)是莧科多年生宿根草本植物,別名水花生、喜旱蓮子草、空心莧。莖基部匍匐,上部伸展,中空,有分枝,葉對生,長圓狀倒卵形或倒卵狀披針形,頭狀花序。根系繁殖能力強,與本地植物爭奪水分、養分。
水葫蘆( Eichhornia crassipes ) ,又叫鳳眼蓮,根生于節上,根系發達,靠毛根吸收養分水分,主根(肉根)分蘗下一代。葉單生,直立,葉片卵形或腎圓形,稈(莖)灰色,泡囊稍帶點紅色,嫩根為白色,老根偏黑色。多年浮水草本。
鳳眼蓮對其生活的水面采取野蠻的封鎖,擋住陽光,導致水下植物得不到足夠光照而死亡,破壞水下動物的食物鏈,導致水生動物死亡。同時,鳳眼蓮還有富集重金屬的能力,死后腐爛體沉入水底形成重金屬高含量層,直接殺傷底棲生物。馬纓丹(Lantana cam ara L inn. )系馬鞭草科多年生植物,又叫五色梅、臭草。多年生蔓性灌木,高1～2 m,葉對生,卵形或心臟形,有臭味。莖枝方柱形,通常有短而下彎的細刺和柔毛。枝葉及未熟果有毒,人畜誤食會造成慢性肝中毒,有發燒、衰弱、嘔吐、腹瀉、步履不穩、呼吸急促、昏迷、黃疸等癥狀。
以上5種植物都是云南常見的入侵植物,對農業生產造成危害,對人畜健康造成影響,對自然環境產生破壞作用;但這些植物都是綠色植物,具有葉綠素,如果能把這些植物中的葉綠素加以充分利用,即能變廢為寶。葉綠素不僅在光合作用中起到吸收光能、傳遞光能的作用,而且還具有造血功能,可解除體內殺蟲劑與藥物殘留,并具有養顏美膚以及多種保健功能(如提供維生素、維持酶活性、解毒、消炎、脫臭) 。就以上5種入侵植物的葉綠素提取工藝進行研究并測定葉綠素含量,可為有效控制這些有害植物的生態危害及進一步合理利用奠定基礎。
1　材料與方法
1. 1　材料
紫莖澤蘭、飛機草、空心蓮子草、馬纓丹采集于楚雄師范學院校園內,水葫蘆采集于校園南大門外池塘。5種試材均由楚雄師范學院李國樹鑒定。另外還需要幾款測定葉綠素含量的儀器，如葉綠素含量測定儀、SPAD502葉綠素儀。1. 2　方法
1. 2. 1　葉綠素的提取　本試驗采用超聲波處理和未超聲處理2種方法,分別提取5種植物的葉綠素。超聲波處理:每個樣品取新鮮試材3 g,剪碎,加入5 ml 80%丙酮、少許碳酸鈣和石英砂研磨勻漿,轉入25 ml燒杯,用KQ5200B 型超聲波清洗器30 ℃超聲處理5 min,過濾,濾液轉入10 ml量筒中,加入少量80%丙酮將研缽洗凈,過濾后濾液一并轉入量筒中,定容至10 ml,混勻,取5 ml轉入25 ml量筒中,加入80%丙酮,并定容至25 ml。未超聲處理:操作過程同上,僅省略超聲波處理程序。
1. 2. 2　葉綠素的光吸收測定及其比較　利用UV - 2401PC型紫外分光光度計,測定超聲波處理和未超聲處理提取液在663 nm和645 nm的吸光度,以80%丙酮為對照;計算樣品葉綠素含量。同時,利用TZZS可見光光度計測定樣品663 nm和645 nm處吸光度,并分別計算樣品葉綠素含量。
2　結果與分析
2. 1　葉綠素吸收峰的分析比較
2. 1. 1　水葫蘆中葉綠素的吸光度　經過超聲處理和未超聲處理的水葫蘆提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見圖1和表1。表1結果表明,水葫蘆超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素最高吸收峰在波長330. 00、330. 50 nm處,最高Abs分別為2. 530 0和3. 474 8。說明水葫蘆在不超聲處理的提取液中葉綠素吸光度高,在提取水葫蘆葉綠素時不用超聲波處理,直接提取效果更好。
2. 1. 2　紫莖澤蘭中葉綠素的吸光度　經過超聲處理和未超聲處理的的紫莖澤蘭提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見圖2和表2。由表2可知,紫莖澤蘭超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素吸光度最高峰在波長319 nm和325 nm處,Abs均為5. 000 0,說明紫莖澤蘭超聲處理和未超聲處理提取液中葉綠素吸光度一樣。
2. 1. 3　馬纓丹中葉綠素的吸光度　經過超聲處理和未超聲處理的馬纓丹提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見圖3和表3。由表3表明,馬纓丹超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素分別在波長321. 50 nm和326. 00 nm處有最高吸收峰,Abs均為5. 000 0,說明馬纓丹超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素吸光度相同。
2. 1. 4　空心蓮子草中葉綠素的吸光度　經過超聲處理和未超聲處理的空心蓮子草提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見圖4和表4。由表4表明,空心蓮子草超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素吸光度在波長432. 50 nm和343. 50 nm處有最高吸收峰,Abs分別為3. 640 7和5. 000 0,說明空心蓮子草的葉綠素不超聲處理提取效果更好。
2. 1. 5　飛機草中葉綠素的吸光度　經過超聲處理和未超聲處理的飛機草提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見圖5和表5。由表5表明,經過超聲處理和未超聲處理的飛機草提取液中葉綠素在波長331. 00 nm和330. 50 nm處有最高吸收峰,Abs分別為5. 000 0和3. 031 4,說明飛機草中葉綠素經過超聲處理提取,效果更好。
2. 1. 6　5種植物超聲處理后的吸收峰比較　由圖6可知,水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機草等5種植物超聲處理后,紫莖澤蘭、馬纓丹和飛機草的最高吸收峰基本相同,而水葫蘆和空心蓮子草的最高吸收峰有明顯差異,即不同的植物材料經過超聲處理后效果不同。
2. 1. 7　5種植物未超聲處理的吸收峰比較　由圖7可知,水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機草等5種植物不經過超聲處理,紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草等3種植物的最高吸收峰基本相同,水葫蘆和飛機草的最高吸收峰有明顯差異,即5種植物不超聲處理直接提取效果一樣。
2. 2　葉綠素濃度的比較
2. 2. 1　5種植物超聲處理葉綠素濃度測定　用UV - 2401PC型紫外分光光度計測定5種植物超聲處理后提取液在波長為663 nm和645 nm 的葉綠素濃度(表6) 。表6結果表明,在波長663 nm 下,空心蓮子草的葉綠素濃度最高( 0. 016 7mg/L) 。在波長645 nm 下, 馬纓丹的葉綠素濃度最高(0. 029 8 mg/L) 。說明在經過超聲波處理的條件下,水葫蘆、馬纓丹、空心蓮子草等在波長663 nm下測濃度為宜,紫莖澤蘭、飛機草在波長645 nm下測定濃度為宜。
2. 2. 2　5 種植物未超聲處理葉綠素濃度測定　用UV -2401PC型紫外分光光度計測5種植物未超聲處理提取液在波長為663 nm和645 nm下的葉綠素濃度(表7) 。表7 表明,在波長663 nm 下, 空心蓮子草的葉綠素濃度最高(0. 046 5 mg/L) ;在波長645 nm下,紫莖澤蘭的葉綠素濃度最高(0. 032 6 mg/L) 。說明在直接提取的條件下,在波長為663 nm下測定空心蓮子草、飛機草的葉綠素為宜,波長為645nm下測定水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹的葉綠素為宜。2. 3　用722S型可見分光光度計測葉綠素吸光度及含量在波長663 nm和645 nm下,用722S型可見分光光度計測量5種植物提取液葉綠素的吸光度(表8) 。
根據文獻[ 2 - 3 ]的方法,將測得的數值代入公式: ( 1) Ca(mg/L) = 12. 7A663 - 2. 69A645 ; ( 2 ) Cb (mg/L ) = 22. 9A645 -4. 68A663 ; (3) Ct =Ca + Cb = 8. 02A663 + 20. 21A645 ,計算出葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的濃度。最后再根據葉綠素提取液濃度計算出單位鮮重葉片中葉綠素的含量(表9、表10) 。
經SPSS軟件對兩種方法提取的葉綠素含量進行處理,得5種植物葉綠素含量的估計邊緣均值,結果空心蓮子草葉綠素含量最高,為0. 430 250 mg/g FW;紫莖澤蘭的葉綠素含量第二,為0. 370 750 mg/g FW; 馬纓丹葉綠素含量第三, 為0. 337 750 mg/g FW; 飛機草第四, 葉綠素含量為0. 310 060mg/g FW;水葫蘆葉綠素含量最低,為0. 111 750 mg/g FW。經統計分析,無論是超聲處理還是未超聲處理, 5種植物間總葉綠素含量差異均達極顯著水平,兩種方法測定的葉綠素含量差異也達極顯著水平。經過超聲處理后,空心蓮子草葉綠素含量最高,其次是飛機草,再次是馬纓丹,然后是紫莖澤蘭,最低的是水葫蘆。未經超聲波處理直接提取葉綠素時,紫莖澤蘭葉綠素含量最高,其次是空心蓮子草,再次是馬纓丹,然后是飛機草,最低的是水葫蘆。兩種方法比較,馬纓丹、空心蓮子草和飛機草超聲處理后提取的葉綠素含量比未超聲處理提取的高;紫莖澤蘭的比未超聲處理提取的低,而水葫蘆沒明顯差異。
3　討論
3. 1　環境因素對葉綠素的影響
杜敏華對女貞、大葉黃楊、月季、金葉女貞、三葉草等5種常見城市綠化植物進行了大氣污染對其葉綠素含量影響的研究,認為污染嚴重的城市區域葉綠素總含量相對較低。那么,其他環境因素,如干旱、低溫、元素缺乏等是否會影響水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機草等5種植物葉綠素的含量? 這有待進一步探討。
3. 2　5種植物的應用前景
游秀花等以杉木針葉提取葉綠素,經皂化、鋅代及成鹽反應制備葉綠素鋅鈉鹽。馬自超用竹葉制取葉綠素銅鈉鹽。能否將水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機草等5種植物中所含的葉綠素轉換為葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉呢? 這5種植物的色素中是否含有毒性? 如果有,如何脫毒效果最好? 這些問題還有待于進一步研究。
4　結論
通過不同的處理方法進行葉綠素提取,發現用不同的處理方法,紫莖澤蘭在波長為310. 00 nm和325. 00 nm條件下,葉綠素吸光度相同且最高(Abs為5. 000 0) 。紫莖澤蘭、空心蓮子草、飛機草、水葫蘆、馬纓丹5種植物材料中,葉綠素含量差異極顯著。5種材料的葉綠素含量從高到底依次為空心蓮子草(0. 430 250 mg/g FW) 、紫莖澤蘭(0. 370 075 mg/g FW) 、馬纓丹(0. 337 750 mg/g FW) 、飛機草( 0. 310 660mg/g FW) 、水葫蘆( 0. 111 750 mg/g FW) 。超聲處理后提取葉綠素和不處理直接提取葉綠素,差異極顯著。紫莖澤蘭以不處理直接提取為宜,馬纓丹、空心蓮子草和飛機草超聲處理后再提取為宜,水葫蘆不受超聲處理影響。這5種常見入侵植物葉綠素的提取和應用前景中,空心蓮子草是葉綠素提取的最佳材料,其次是紫莖澤蘭和馬纓丹。