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蛋白質是人類營養三要素之一,它是人體內一切組織的基本組成,它在生命現象和生命過程中起著決定性的作用。因此說蛋白質是維持生命所不可缺少的物質。人體不能合成蛋白質,只能從食物中攝取,而食物中的蛋白質則是人體獲取蛋白質的一個重要來源。因此通過測定食品中粗蛋白質含量的多少,可以評價食品的營養價值,為合理利用食品資源,科學安排人民群眾的膳食結構提供科學依據。

目前,食品中粗蛋白質的測定,是采用GB/ T500915- 2003《食品中蛋白質測定》標準中第一法:凱氏微量定氮法作為基本方法的。凱氏定氮法使用到的儀器有全自動凱氏定氮儀或者簡稱為蛋白質測定儀。蛋白質是由多種氨基酸組成的天然高聚物,而氨基酸則是由羧酸分子中烴基上的一個或幾個氫原子被氨基取代后所生成的化合物,為一類含氮的有機化合物,同種食品中的蛋白質,其所含各種氨基酸的組成及種類有一個固定的比例,不同種的食品中其蛋白質所含各種氨基酸的比例略有不同。總的來說,食品中的蛋白質的含氮量約在15 - 19 % ,其中小麥中的蛋白質含氮量較高,約為1715 %左右,而其它谷物及豆類中蛋白質的含氮量約為16 %左右,根據此含氮百分比,通過測定食品中的含氮量即可換算出蛋白質的百分含量。

凱氏微量定氮法就是通過測定試樣中的氮的含量,然后換算成蛋白質的含量。凱氏微量定氮法試驗原理為:將粉碎的試樣在硫酸鉀─硫酸銅混合物的催化作用下中,加入硫酸加熱消化,其中所含的蛋白質與硫酸反應,蛋白質的主要成份碳、氫、氧分別生成了二氧化碳、水等,而蛋白質中氨基酸中的氨基─NH2 則由于不易被氧化而得到一個氫原子生成氨(NH3 ) ,氨與過量的硫酸反應生成銨鹽即硫酸銨[ (NH4) 2SO4 ] ,在消化后所得到的含硫酸銨的消化液里加入過量的堿,使溶液呈堿性,通過加熱使硫酸銨分解生成氨并被蒸餾出來,然后用硼酸吸收蒸餾出來的氨,生成四硼酸氫銨(NH4HB4O7 ) ,最后用酸標準溶液中和其中的氨,從而定量的計算出氨的含量,最后換算成蛋白質的含量。因為在食品中,除蛋白質外,還含有其它有機含氮化合物,其中所含的氮在硫酸的作用下,也有一部分能反應生成氨,所以此方法測得的氮的含量,包括了非蛋白質中有機含氮化合物中的氮,所以用此法測得的蛋白質的結果,不是純蛋白質的結果,而稱之為粗蛋白質的結果。如需測定純蛋白質的含量,則需將試樣中非蛋白質的有機含氮化合物分離出去,然后再采用凱氏微量定氮法進行測定。得到的結果即是純蛋白質的結果。總的來說,凱氏微量定氮法包括三個過程:消化、蒸餾、滴定。其各過程的主要反應如下:

蛋白質測定之消化:

RCHNH2COOH + H2SO4 →H2O + CO2 ↑+ SO2 ↑+(NH4) 2SO4

RCHNH2COOH 為蛋白質中氨基酸的結構通式,其中R 為烴基。

蛋白質測定之蒸餾:

(NH4) 2SO4 + NaOH →NH3 ↑+ Na2SO4NH3 + H3BO3 →NH4HB4O7

蛋白質測定之滴定:

NH4HB4O7 + HCl →NH4Cl + H3BO3

應用凱氏微量定氮法測定粗蛋白質試樣用量少,反應復雜,如操作條件掌握不好;試驗結果的重現性比較差。通過多年應用凱氏微量定氮法測定粗蛋白質的實踐,總結出影響粗蛋白質測定的因素有以下幾點:

1 　稱樣量

測定粗蛋白質時要注意試樣的稱樣量不能太大,尤其是對蛋白質含量較高的試樣,如大豆等。如果稱樣量大: ①消化時間長,硫酸的消耗量大,也容易造成消化不完全,蛋白質中的氮不能完全轉化為氨,可導致測定結果偏低; ②消化時比較激烈,泡沫較多,也易導致消化不完全。所以稱樣是應根據蛋白質含量的大約范圍,按含粗蛋白質不超過30 毫克來計算試樣稱用量。

2 　試樣的消化過程對粗蛋白質測定結果的影響

試樣的消化是影響粗蛋白質測定結果的一個重要因素,由于消化時試樣少,溫度高,反應激烈,消化條件如掌握不好也容易引起消化時間增長,消化不完全,或造成試樣中的部分氮損失等。以筆者多年實踐經驗,樣品消化時要注意以下幾個方面: ①試樣中加入硫酸銅和硫酸鉀是起提高反應溫度,加快反應速度的作用,但加入的硫酸鉀不可過多,因為硫酸鉀加入量過多,可導致消化液的沸點過高,從而使消化液的溫度過高,在過高的溫度下,硫酸會形成細小液滴攜帶試樣而被蒸出,從而使氮損失造成結果偏低。②剛開始消化時要嚴格控制溫度,只能做較低溫度的加熱,不能過高,最好使用可調電爐,或在電爐上多加幾層石棉網,避免溫度過高。因為剛開始消化時,消化比較激烈,泡沫也比較多,溫度高,消化過于激烈沸騰,易造成試樣隨液體噴濺出來,或隨泡沫溢出燒瓶,使試樣損失,尤其是含脂肪較高的試樣,試樣在加熱極易產生大量泡沫并溢出平外。而且消化過快時,易引起副反應,可能使部分氮被氧化變成分子狀態揮發逸出,造成結果偏低;消化時過于激烈沸騰,泡沫也會將試樣濺到瓶壁上、瓶頸處,高溫焦化后不易洗脫,尤其是濺到瓶頸處,更不易洗脫下來,也容易造成后期消化困難和消化不完全,使結果偏低。所以消化時,一般需微微加熱(10～20)min 后,泡沫減少,消化液大部分呈灰黑色透明液,二氧化硫白色煙霧增加時,方可升高溫度,使溶液保持微沸狀態,因為此時消化液中有許多由試樣形成的炭化顆粒。

盡管前期消化時間長一些,但形成的炭化顆粒少,可使后期消化的時間大大減少,消化完全。③在消化后期,對濺附在燒瓶壁上的黑色焦化物質,須轉動燒瓶將其振洗下來,以避免試樣損失。在消化過程中,如硫酸———過氧化氫———水混合液消耗量大,則應酌情補加部分混合液繼續消化,以避免燒瓶干枯,溫度過高,造成硫酸銨過熱分解,造成氨的損失。

3 　蒸餾過程對粗蛋白質測定結果的影響

蒸餾時加入蒸餾瓶內的堿溶液必須過量,因為在消化液中還有一部分硫酸,因此加入的堿液一部分將與硫酸中和,過量的堿溶液將使消化液保持較強的堿性,有利于使消化液中的氨完全蒸出,必要時可酌情多加一部分堿液。在蒸餾瓶中加入稀釋后的消化液前,應注意要先將接受瓶及接受液(硼酸溶液) 準備好,并將冷凝管插入接受液的液面下,因為在加入消化液后,再加入過量的堿溶液時,消化液中的氨易揮發逸出;另外,在蒸餾瓶多次使用時,蒸餾瓶本身也具有一定溫度,也易加快氨的逸出,這些都會影響分析結果準確性。以上是在粗蛋白質測定實踐中總結出的幾點膚淺的經驗,在操作時,應嚴格遵守國際操作規程,掌握好操作條件,在操作中,應盡量避免氮的損失,可以取得比較準確的分析結果。